進入Ensembl 的首頁，搜尋格輸入species: Mouse & 基因名稱。
點選此項結果的gene，進入後看到gene的詳細資料。
2. 如何查詢 gene 可用的 BAC (129 strain)?
進入Ensembl 的首頁，搜尋格輸入species: Mouse & 基因名稱
點選此項結果的gene，進入後看到gene的詳細資料
點選 location 的標籤，點選 configure this page
在 main panel 的標籤下點選 other DAN alignment
點選 (force) labels ens_m37_129AB22
點選右上角 save & close
最後調整表格大小，建議挑選將 gene 包含在BAC 中段的 clone
並建議至少買2個 BAC clone。
3. 如何查詢 gene 可用的 BAC (B6 strain)?
進入Ensembl 的首頁，搜尋格輸入species: Mouse & 基因名稱
點選此項結果的gene，進入後看到gene的詳細資料
點選 location 的標籤，點選 configure this page
在 main panel 的標籤下點選 external data
點選 (force) labels BAC map
點選右上角 save & close
最後調整表格大小，建議挑選將 gene 包含在BAC 中段的 clone
並建議至少買2個 BAC clone。
Ex. Ensemble 查到的Clone ID為RPCI-23-438J6, 請在BAC PAC訂購時將 " CI- "去掉, 成為RP23-438J6, 才符合BAC PAC的訂購格式.
Genomic DNA
sequence的紙本需包含：
1.雙股序列
2.Exon及intron的位置與編號，reading
frame
3.EcoRI、BamHI、NotI、SalI、SpeI、HindIII、AflII、PacI、AvrII、PmeI、ScaI
的RE切點分析
4.已有的primer位置(如果有的話)
1. 129 strain
進入 LifeSciences 的首頁 http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/
點選右上方 Buy Now 內的 Clone plates/libraries =>libraries 選擇 bMQ mouse BAC library (129S7AB2.2)
在表格內填寫要訂購的 BAC 後點選下 方 Buy Now
之後點選 Continue
再根據網頁上的指示一步步完成訂 購程序
2. B6 strain
進入 BACPAC Resource Center (BPRC) 的首頁 http://bacpac.chori.org/
點選 Online Order 下選擇列表中的 Place Order => Order Clones
填入 B6 的 BAC clone number (RP開頭)
填寫表格後點選 Verify these clones
之後點選 Checkout，此時會要求申請帳號密碼
之後根據網頁上的指示一步步完成訂購程序
Chloramphenicol (25μg/ml)
滅過菌的去離子水
準備40μg以上的DNA給核心實驗室，請使用跑電泳半定量方式定量，並在移交時附上移交單。
9. 如何製備 ES cell targeting 用的 DNA?
1. 質體的抽取
核心建議使用 EndoFree Plasmid Maxi Kit 從細菌中抽取標的載體 DNA。
相關的實驗步驟請參閱使用說明書。
此外，本核心也接受以 CsCl banding備製的DNA。
2. 標的載體 DNA 直線化
交至核心的標的載體 DNA 需經直線化處理。200μg DNA 經適當的限制酶切割後，取少量 DNA 跑 mini-gel(約取100ng)，確定 DNA 直線化完全，以 2 次 phenol 及 2 次 chloroform 萃取後加入 1/20 V 5M NaCl混合均勻後加入 2V 100% 酒精沈澱。
請移交200μg酒精沈澱的linearized DNA與200μg未linearized DNA及移交單
給核心實驗室進行後續實驗。移交單請至使用者園地=>相關表單下載。
10. 如何做 targeting vector construct?
請參照 A Highly Efficient Recombineering-Based Method for Generating Conditional Knockout Mutations. Liu P, Jenkins NA, Copeland NG.Genome Res.
2003 Mar;13(3):476-84