作業流程
A4-10 Cre重組酶轉染胚胎幹細胞
使用者提供條件式基因標的載體及載體建構資訊 (格式如〝Cre重組酶轉染胚胎幹細胞服務使用規範〞)。
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核心確認書面之載體建構資訊。
核心依〝Cre重組酶轉染胚胎幹細胞實驗流程〞(如下) 進行小鼠胚胎幹細胞轉染實驗。
核心提供標的後細胞株供使用者篩選。
核心待使用者回報細胞株篩選結果後，將正確標的之細胞株解凍培養至106後，交予使用者或進行後續服務。
寄發服務完成通知。
Cre/Flp重組酶轉染胚胎幹細胞實驗流程
1. 以trypsin收下細胞 ，以PBS清洗，控制細胞濃度為5x106細胞/mL。。
2. 準備好會表現Cre重組酶的質體DNA 10 μg及 4x106細胞。
3. 加入電擊管後，打開電擊器，設定條件為240 V，500 μF。
4. 電擊後讓細胞靜置5分鐘。
5. 種至B10盤中 。
以trypsin將細胞打散，以序列稀釋的方式，取約150顆細胞種至B10盤。
每隔一天更換一次培養液
1. 準備足夠兩盤24-well (先鋪好纖維母細胞)。
2. 準備一盤96-well，於每個well中加入50μL的 trypsin。
3. B10去掉約4ml的培養液，tip尖端先吸取少量的trypsin，再從B10中挑選型態完整的細胞株至96-well，挑選完再將細胞以吹吸的方式打散後加入含有1ml培養液的24-well培養基中。
1. 準備兩盤24-well (鋪上gelatin即可)。
2. 將已長滿的選殖胚胎幹細胞株以PBS潤洗後，加入各100μl的trypsin，37℃反應二至三分鐘後，將細胞打下，加入0.4 ml 的培養液終止反應。
3. 取100 μl 細胞液至已準備好的24-well中，繼續培養,以做日後DNA萃取所用。
4. 剩餘的細胞液則加入0.6ml 16.67%的抗凍劑，混合均勻後封好儲存於-80℃冰箱中備用。
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