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A4-12
南方墨點法篩選用探針測試服務標準流程
1.使用者提供胚胎幹細胞DNA篩選用探針及相關篩選資料
2.核心依據使用者提供的資料〝南方墨點法的探針測試使用規範〞、與〝南方墨點法實驗流程〞(如下)，進行實驗。
3.核心將測試結果交予使用者。
4.寄發服務完成通知。
實驗流程
一
雜交反應（Hybridization）
第一天：
↓預熱
pre-hybridization
溶液【註一】42
℃;
約
15 ml/membrane。
↓取適量
salmon sperm DNA (ssDNA)，100
℃水浴
8-10
分鐘，旋即置冰浴冷卻 2
分鐘(Working
concentration：100
μg/ml) 加入pre-hybridization
溶液，混合均勻。
↓桌上平鋪保鮮膜，取
mesh 鋪上，加約
50 ml 2X SSC潤濕。
↓取出
測試用membrane，DNA面朝下，置於
mesh
上，將其浸潤後確定無氣泡再捲起，放入雜交用玻璃瓶管中。
↓加入約
20 ml 2X SSC慢慢旋轉輕敲瓶子，使membrane與
mesh
慢慢展開緊貼於管壁。
↓將
2X SSC
倒出，盡量倒乾。
↓將製備好的pre-hybridization溶液倒入。
↓放入42
℃雜交烘箱中，旋轉混勻，作用過夜。
第二天：↓預熱
hybridization
溶液【註二】42
℃約
30 ml/每瓶。
↓取適量
ssDNA，100℃
水浴
8-10
分鐘後旋即冰浴冷卻 2
分鐘後，加入hybridization溶液混合均勻
(Working conc.：100
μg/ml)。
↓ 將
DNA 探針稀釋至
20~50 ng /45 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0，1
mM EDTA)。
↓100
℃水浴
5 分鐘旋即冰浴冷卻
2 分鐘。
↓將變性成單股之探針取45μl加入一管Radi-prime
(Amersham)中。
↓再取
5 μl α-32P dCTP加入後混合均勻。
↓37
℃，作用
30 分鐘。
↓加入
5 μl 0.2 M EDTA混合均勻以停止反應。
↓將標定好之探針利用層析柱〝Push
column〞【註三】純化。
↓將純化完成之探針於
100
℃水浴
5 分鐘，旋即冰浴冷卻2分鐘。
↓將
42
℃
中的雜交瓶取出，將
pre-hybridization
溶液倒出
(盡量倒乾)。
↓將製備好之雜交溶液倒入，並加入適量製備好的探針混合均勻。
↓放入42
℃雜交孵育箱中，使旋轉混合過夜。
第三天：↓將42℃中的雜交瓶取出，將雜交溶液倒入貯存桶(含有放射性元素)，將貯存桶置於壓克力箱中。
↓加入
50 ml solutionⅠ【註四】至雜交瓶後放入雜交烘箱中，旋轉混合數分鐘。
↓將solutionⅠ倒存於收集瓶，置收集瓶於壓克力箱中
(盡量倒乾)。
↓再加入solutionⅠ至雜交瓶中，放入雜交孵育箱中，旋轉混合數分鐘。
↓將solutionⅠ倒出(盡量倒乾)。
↓將membrane取出與
mesh 分開。
↓加入約
300 ml solutionⅠ，振盪
20~30 分鐘。
↓使用蓋格計數器
(GM counter)
偵測溶液及DNA膜，若計數＞50
cpm，更換solutionⅠ。
↓用solution
I 將DNA膜放射性計數沖洗稀釋至約
20~50 cpm。
↓若訊號仍
> 50 cpm，可將洗液換成solution
II【註五】。
↓若訊號仍
> 50 cpm，可加高溫度清洗，每次加高
5℃。
↓清洗完後以
2X SSC沖洗。
↓將
DNA 膜置於
3M 濾紙上，使
DNA
面朝上，用保鮮膜包起。
↓壓X光片感光
(-70 oC)
至適當時間後沖洗取得結果。
【註一】 prehybridization
solution：
Formamide 200 ml
20X
SSC 100 ml
50X
Denhardts 40 ml
10%
SDS 4 ml
補水至
400 ml
【註二】hybridization solution：
Formamide 200 ml
20X
SSC 100 ml
50X
Denhardts 40 ml
50%Dextran 40 ml
10%
SDS 4 ml
補水至
400 ml
【註三】
利用〝Push
column〞(Stratagene)
純化
32P-DNA
↓將Push
column加80
μl STE (100 mM NaCl, 20 mM
Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA)
潤濕。
↓將約
55 μl 探針反應物加入
column 中。
↓過濾收集於
Eppend. 管中。
↓再加入
80
μl STE buffer。
↓過濾過濾收集於同一Eppend.管中。
【註四】solutionⅠ：
2X SSC , 0.1％
SDS
【註五】solution
II：
0.1X SSC , 0.5％
SDS
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