作業流程
A4-2 胚胎幹細胞基因標的服務流程
使用者提供基因標的載體及載體建構資訊 (格式如〝基因標的載體建構服務使用規範〞)。
‾
核心確認書面之載體建構資訊。
核心依〝胚胎幹細胞基因標的實驗流程〞(如下) 進行小鼠胚胎幹細胞標的實驗。
核心提供標的後細胞株供使用者篩選，並貯存備用細胞株一套至-80℃冷凍，存放至多3個月。
核心待使用者回報細胞株篩選結果後，將正確標的之細胞株解凍培養至106後，交予使用者或進行後續服務。
寄發服務完成通知。
胚胎幹細胞基因標的實驗流程
1. 繼代培養小鼠胚胎幹細胞，並分盤至2盤P100平盤。
2. 準備8盤P100內含有具Ｇ418抗性基因的小鼠纖維母細胞。
1. 以trypsin收下細胞計數，接著以PBS打散細胞，然後以PBS調至1x107細胞/mL PBS。
2. 準備線型DNA，每個電擊試管需20μg線型DNA及8x106細胞(每一案件進行兩管電擊轉染)。
3. 將細胞與DNA全部加入電擊管後，打開電擊器，設定條件為 240V，500μF，隨即進行電擊。
4. 電擊後將其靜置5分鐘。
5. 分別分種於8盤P100平盤中加入培養基培養。
更換培養液為含有G418 (200 mg/mL) 的培養基，進行正篩選，當neo基因轉染入真核細胞後，細胞應獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。
更換培養液為含有 G418 (200 mg/mL)及 Gancyclovir (2mM) 的培養基，進行負篩選。
1. 準備足夠量的已先鋪好纖維母細胞之24-well平盤，將培養基換成1 ml的ES細胞培養基。
2. 準備一盤96-well，於每個well中加入50μL的trypsin。
3. 自P100平盤吸去約4 mL的培養液。
4. 用pipetman (P200) 以tip尖端自96-well先吸取少量的trypsin，再從P100平盤中挑選型態完整的細胞株至96-well，挑選完再將細胞打散後加入24-well中。
1. 準備足夠量的已鋪上gelatin之24-well平盤。
2. 將已長滿於24-well平盤的小鼠胚胎幹細胞株以PBS潤洗後，各加入100μl的trypsin，37 ℃培養2~3分鐘後，再加入0.4 ml的培養液終止反應，並將細胞打散。
3. 取100μl至已準備好的24-well平盤中繼續培養，以做日後DNA萃取所用。
4. 剩餘的0.4 mL 則加入0.6 mL 16.67 % 的抗凍劑，混合均勻後封好儲存於—80℃。
回首頁
