A4-14 細菌人工染色體萃取服務標準流程
1.
使用者向
Geneservice
購買
BAC clone,並作凍菌保存。
2.
使用者需提供基因標的載體所需的菌株,本核心接受以塗盤式培養皿的方式移交2株菌株
3.
使用者提供欲進行細菌人工染色體萃取相關資訊
(格式如〝細菌人工染色體萃取服務使用規範〞)。
4.
核心依據〝細菌人工染色體萃取實驗流程〞(如下),進行實驗。
5.
核心依使用者規範提交使用者每一菌株40μgDNA。
6.
寄發服務完成通知。
實驗流程
↓從使用者提供的培養皿中挑選single
colony到5ml
LB(25μg/ml chloramphenicol)
37℃,180rpm,14~16小時
↓Transfer到50ml
LB(25μg/ml chloramphenicol),37℃,180rpm,9~10小時
↓Transfer到1L
LB(25μg/ml chloramphenicol),37℃,180rpm,14~16小時
↓使用MN
Plasmid DNA Purification NucleoBond PC500 kit進行萃取服務
1.
離心5000rpm,4℃,15分鐘
2.
去上清液,加入40ml
S1 Buffer,混合均勻
3.
加40ml
S2 Buffer,混合均勻,不可vortex
4.
加40ml
S3 Buffer,混合均勻,不可vortex
5.
置冰上5分鐘
6.
將lysate倒入Folded
filter,filter下接AX500
column
7.
加18ml
N3 Buffer wash,並將N5
Buffer加熱至55℃
8.
加15ml
N5 Buffer elution(AX500 column下接corex
Tube)
9.
加11ml
isopropanol,混合均勻
10.
12000rpm離心,4℃,30分鐘,
11.
去上清液後加5ml
70%酒精
12.
12000rpm離心,4℃,10分鐘
13.
去上清液後air
dry
14.
回溶ddH2O,4℃保存
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