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第一天： |
準備3盤P100平盤內含小鼠纖維母細胞。 |
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第二天： |
解凍小鼠胚胎幹細胞至其中一盤P100平盤。 |
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第三天： |
1.
繼代培養小鼠胚胎幹細胞，並分盤至2盤P100平盤。
2.
準備8盤P100內含有具Ｇ418抗性基因的小鼠纖維母細胞。 |
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第四天： |
1.
以trypsin收下細胞計數，接著以PBS打散細胞，然後以PBS調至1x107細胞/mL
PBS。
2.
準備線型DNA，每個電擊試管需20μg線型DNA及8x106細胞(每一案件進行兩管電擊轉染)。
3.
將細胞與DNA全部加入電擊管後，打開電擊器，設定條件為
240V，500μF，隨即進行電擊。
4.
電擊後將其靜置5分鐘。
5.
分別分種於8盤P100平盤中加入培養基培養。 |
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第五天： |
更換培養液為含有G418
(200 mg/mL)
的培養基，進行正篩選，當neo基因轉染入真核細胞後，細胞應獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。 |
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第六天： |
更換培養液為含有
G418 (200 mg/mL)及
Gancyclovir (2mM)
的培養基，進行負篩選。 |
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第七~十一天： |
每隔一天更換一次含有
G418
及
Gancyclovir
的培養基。 |
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第十二天： |
1.
準備足夠量的已先鋪好纖維母細胞之24-well平盤，將培養基換成1
ml的ES細胞培養基。
2.
準備一盤96-well，於每個well中加入50μL的trypsin。
3.
自P100平盤吸去約4
mL的培養液。
4.
用pipetman
(P200) 以tip尖端自96-well先吸取少量的trypsin，再從P100平盤中挑選型態完整的細胞株至96-well，挑選完再將細胞打散後加入24-well中。 |
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第十三天： |
更換培養液。 |
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第十三~十七天： |
每兩天更換一次培養液。
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第十七天： |
1.
準備足夠量的已鋪上gelatin之24-well平盤。
2.
將已長滿於24-well平盤的小鼠胚胎幹細胞株以PBS潤洗後，各加入100μl的trypsin，37
℃培養2~3分鐘後，再加入0.4
ml的培養液終止反應，並將細胞打散。
3.
取100μl至已準備好的24-well平盤中繼續培養，以做日後DNA萃取所用。
4.
剩餘的0.4
mL
則加入0.6
mL 16.67 %
的抗凍劑，混合均勻後封好儲存於—80℃。 |
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第二十一天： |
此時做DNA萃取用的細胞大略已長滿，依據在顯微鏡下所見的細胞生長情形做記號，全滿記錄為3，很少記錄為1，介於中間者為2。標記好的細胞可進行DNA萃取，並以南方墨點法或PCR的方式確認其基因型。
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第二十一天以後至基因型確定時： |
如使用者提出，可將確定為已標的之正確細胞株解凍後，利用轉染方式將Cre重組酶基因轉染至細胞株，挑選基因剔除之細胞(參照〝A4-10
Cre重組酶轉染胚胎幹細胞服務流程〞)。 |
